幽门螺杆菌耐药性检测主要通过胃黏膜活检标本培养药敏试验、分子生物学检测、快速尿素酶试验改良法等方法实现，需在医疗机构由专业医生操作。
胃黏膜活检标本培养药敏试验是检测幽门螺杆菌耐药性的金标准，通过内镜获取胃黏膜组织后进行细菌培养，直接测试菌株对不同抗生素的敏感性，结果准确但耗时较长。分子生物学检测采用PCR技术检测幽门螺杆菌耐药基因突变，如23S rRNA基因突变提示克拉霉素耐药，gyrA基因突变提示喹诺酮类耐药，该方法快速但需特定设备。快速尿素酶试验改良法在传统检测基础上加入抗生素，通过尿素酶活性变化间接判断耐药性，操作简便但准确性相对较低。部分医疗机构采用表型检测方法，如E-test法可在培养后直接读取抗生素最小抑菌浓度。临床实践中常结合患者既往用药史和地区耐药流行病学数据综合评估。
进行幽门螺杆菌耐药性检测前应停用抗生素4周以上，停用质子泵抑制剂2周以上，检测期间避免饮酒及刺激性食物，选择正规医疗机构进行操作，检测后根据结果在医生指导下制定个体化治疗方案，治疗期间严格遵医嘱用药并完成全程治疗，避免自行调整药物导致治疗失败或耐药性加剧，治疗后需复查确认根除效果，日常生活中注意分餐制、餐具消毒等预防措施。