异硫氰酸主要通过十字花科植物中的硫代葡萄糖苷酶解生成，常见于芥末、西蓝花等食物中，也可由化学合成或微生物代谢产生。
十字花科植物中的硫代葡萄糖苷在黑芥子酶作用下水解，生成异硫氰酸，该过程在植物组织破损时被激活。
通过硫氰酸盐与酰氯类化合物反应制得，实验室常采用此方法制备高纯度异硫氰酸衍生物。
部分土壤细菌能分解含硫有机物产生异硫氰酸，这种生物合成途径在自然界硫循环中起重要作用。
腌制或发酵过程中，食物中的硫化物经化学反应可形成异硫氰酸，如芥末酱的特殊风味即来源于此。
摄入含异硫氰酸的食物需适量，过量可能刺激胃肠黏膜，烹饪时适当加热可降低其活性。
