人参皂苷Rh2对白血病的作用

观察人参皂苷Rh2对人白血病细胞株HL60增殖及凋亡的调节作用。

方法：利用流式细胞术检测白血病细胞株HL60在人参皂苷Rh2处理过程中细胞增殖周期的改变及凋亡发生的情况；另一方面通过动物实验，将药物处理前后的细胞株注射裸鼠，验证该药物是否能够有效抑制HL60细胞在动物体内的恶性增殖及白血病症状。

结果：药物处理后的HL60细胞在G1期比例降低，S期比例显著升高（P<0.05），药物处理后HL60细胞早期及中晚期细胞凋亡率为40%左右，明显高于未处理组HL60细胞，人参皂苷Rh2通过介导S期阻滞作用从而使HL60细胞进入凋亡程序。

通过动物实验证明了人参皂苷Rh2能够抑制HL60细胞在体内的恶性增殖。结论：人参皂苷Rh2能够抑制人白血病细胞株HL60的恶性增殖并促进其发生凋亡。人参是中医药传统的补气要药，以其攻补兼施、毒副作用小或无、注重整体的优越性已得到广泛认可。

人参皂苷单体Rh2是从红参中提取的天然活性成分，具有很高的抗肿瘤活性。以人白血病HL60细胞株为受试对象，研究人参皂苷单体Rh2对HL60细胞增殖和凋亡的影响，为进一步阐明人参皂苷单体抗白血病作用的机制，使其应用于白血病的临床治疗提供更多的实验依据。材料与方法1.材料1.1细胞培养HL60细胞为第二军医大学医学发育生物学中心馈赠，用含10％小牛血清（杭州四季青生物公司）的RPMI1640（Gibco）在37℃、5％CO2的培养箱中培养。细胞培养板、培养瓶、培养皿（FALCON，BD）。

1.2人参皂苷Rh2配液人参皂苷Rh2（购置上海同田生物技术有限公司）溶于PBS（pH值7.4）中配成50g/L母液，超滤除菌，-20℃保存备用。用RPMI1640配成所需工作浓度50mg/L，4℃保存备用。1.3动物BALB/cNu品系裸鼠共24只，3-5周龄，雌雄各半，体质量约15-25g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，合格证批号为SXCK（沪）2007-0005。

2.方法2.1观察人参皂苷单体Rh2对细胞生长的抑制作用取对数生长期细胞制成细胞悬液，浓度1×104/mL，接种于24孔培养板内，每孔1mL。6h后加入不同浓度的人参皂苷单体Rh2，使终浓度分别为6.25、12.50、25.00、50.00、100.00mg/L，每一质量浓度组均设4孔。12、24、36、48、60、72h，每次取3孔细胞，轻轻吹打均匀，血细胞计数板（密理博细胞计数器）计数，每孔数3次，计算细胞生长抑制率。细胞生长抑制率=[1-（处理组细胞绝对数/对照组细胞绝对数）]×。

2.2细胞凋亡检测分别收集未处理组HL60细胞和药物处理组HL60细胞，每组约为2×105个细胞，离心去上清，加入100μLPBS。室温避光孵育30min后，2mLPBS洗涤2遍，加入400μLPBS，上机检测前5min加入5μLPI（50μg/μL）。流式细胞仪LSRⅡ（BDBiosciences）计数10000个细胞，检测细胞凋亡。

2.3细胞周期测定收集未处理组HL60细胞和工作浓度药物处理3d后HL60细胞，每组约为1×106个细胞，至离心管中，离心去上清后加入70%乙醇，混匀，4℃固定24h。将固定过的细胞用PBS洗2遍，加入100μLPBS，混匀。加入50μLRNA酶（1mg/mL）37℃消化30min，各管再加入400μLPBS并将细胞液转入相应流式管中，上机前5min各管加50μLPI（250μg/μL），混匀。流式细胞仪计数10000个细胞，检测细胞周期分布；分析软件采用ModfitLT3.0。

2.4在体裸鼠动物实验BALB/cNu品系裸鼠共24只，随机分为3组。收集药物处理后的HL60细胞和野生组HL60细胞，每组取2×105细胞，离心去上清，加入200μLPBS，取1mL注射器抽取细胞悬液注射入裸鼠腹部皮下。SPF级喂养，每日观察。各组裸鼠分别于注射细胞后1个月颈椎脱臼活杀，观察组织和器官的颜色、光泽、质地、有无结节等。分别取肺脏、肝脏、肾脏、脾脏等组织器官，福尔马林固定后HE染色进行病理学检查。

2.5统计学方法采用SPSS17.0软件进行数据分析，总体采用方差分析，P＜0.05表示差异有统计学意义。

结果1.人参皂苷Rh2对HL60细胞生长的抑制作用人参皂苷Rh2可明显抑制HL60细胞的增殖，并呈剂量和时间依赖性，适药物浓度为50μg/mL、时间为72h对细胞增殖影响变化明显，药物处理组细胞的生长抑制率达42.5%。2.人参皂苷Rh2对HL60细胞周期的影响工作浓度药物处理细胞3d后进行流式细胞周期检测，图1结果显示对照组G1期细胞占72.85%、S期细胞占20.76%、G2期细胞占6.39%。药物处理组G1期细胞占38.32%、S期细胞占55.97%、G2期细胞占5.71%。

两组试验数据方差分析结果为：P=0.000<0.05，提示人参皂苷Rh2可介导HL60细胞发生S期的阻滞作用。3.AnnexinV-FITC/PI双染色法流式细胞检测细胞凋亡：从图2双标记的流式散点图上显示：左下象限是活细胞，即FITC-/PI-；右上象限是坏死细胞和凋亡晚期细胞，即FITC+/PI+；右下象限是早期凋亡细胞，即FITC+/PI-；通过分析计算可得到各类型细胞的比例。流式结果显示药物处理后坏死细胞和凋亡晚期细胞占总细胞比例的40.80%，早期凋亡细胞占总细胞比例的41.99%，而未处理组HL60细胞坏死细胞和凋亡晚期细胞占总细胞比例的6.00%，早期凋亡细胞占总细胞比例的7.45%，两组实验数据方差分析结果P=0.000<0.05，提示人参皂苷Rh2能够促进HL60细胞发生凋亡。4.动物一般情况观察观察发现，注射未处理HL60细胞株组的裸鼠与注射人参皂苷Rh2处理后的HL60细胞株及对照组裸鼠相比，注射1-2周开始消瘦并且不爱运动。8周后开始活杀裸鼠，并进行全面的大体解剖检查，发现注射了未处理组HL60细胞株的裸鼠脾脏均有不同程度的肿大增生情况。肿大的脾脏表面光滑，质地柔软。而注射了药物处理后HL60细胞株的裸鼠脾脏增生较弱。5.各脏器病理检查注射了未处理组HL60细胞株的裸鼠的脾脏、肝脏、肺脏和肾脏等器官有明显的炎症、肿胀、充血和大量淋巴细胞浸润现象，有坏死发生。