多巴胺荧光探针 脑图谱的“指路明灯”

一阵浓郁的蕉香袭击着黑暗中的一只果蝇，它“嗡嗡”地兴奋起来，振翅要凑过去。记者近日走访北京大学生命科学学院发现，研究人员正在试图捕捉这只被钉在显微镜下的果蝇的“思想活动”。“我们可以直接观测到，果蝇感应到气味之后，脑中的多巴胺浓度变化。”正在做实验的博士生曾健智说，“一会儿还会给它一些电信号刺激，观察脑中多巴胺在不同刺激下的响应。”

“闻香起舞”这个简单的画面在“脑图谱”的维度是复杂的——香蕉挥发出的香气分子被果蝇的嗅觉细胞捕获，激发了嗅觉细胞通路中的信号转换，将化学信号转变为神经电信号传送至脑，电信号的到来催促着体内多巴胺的分泌，通过打开细胞内的通路，将神经信号中气味分子的信息传递出来。

如同“多米诺骨牌”，外界的刺激一张张传递下去，激起了生物体的反应。由于多年来对活体动物思维的即时、定位观测始终未能实现，这些反应具体发生在大脑中的哪个部分，人类仍无从得知。日前，新一期《细胞》杂志刊登了北京大学生命科学学院研究员李毓龙团队的研究成果：通过基因构建的方法，他们开发出多巴胺荧光探针，宛如在深邃的思想迷宫中点燃“火把”，为此类相关研究“照亮”了多巴胺神经环路。

动态示踪多巴胺信号变化

“将水母中的荧光基因和人源G蛋白偶联受体（GPCR）基因联合在一起，我们获得了可以动态示踪多巴胺的工具。”李毓龙告诉记者，这听起来很简单，但是神经活动的特性对探针提出了严苛要求。神经活动是稍纵即逝的，它必须反应迅速；多巴胺的生成可能是痕量的，因此它必须敏锐；示踪多巴胺必须可信不“犯错”，它必须准确无误……只有符合这些铁一般的律条，才具备资格成为广泛应用的研究工具。

打磨工具的“原材料”正是能够和多巴胺结合的GPCR。“它是一个跨膜蛋白，它在结合多巴胺后会引发自身的构象变化，我们想，如果能够让这样的构想变化产生荧光，或能解决问题。”论文第一作者之一的北京大学生命科学学院博士井淼解释道。这可以通俗地比喻为，多巴胺“按下”的按键此前只打开了大门，而要打造的新工具能让打开的大门同时亮灯。

为此，团队选择了5种GPCR亚型作为备选原材料。“我们利用分子克隆的方法将编码荧光蛋白的基因与五种多巴胺受体的基因拼接起来，通过对融合蛋白的表达、定位及受体对多巴胺的亲和力等指标筛选出最好的亚型。”井淼说。

人工“拼接”后的基因表达会不会被细胞“认可”？打造一款高效“探针”的第一个阻碍来自细胞内部。“正常的GPCR是膜蛋白，要检测细胞外出现的多巴胺信号，蛋白必须要上膜，加了荧光蛋白以后，GPCR的性质可能会变化，无法上膜。”井淼说。

精密运转的细胞在“零件”被改变之后能否正常运转、经过修饰的全新蛋白能否“继承”原有的功能、基因遵循密码子原则转录翻译为氨基酸序列之后的蛋白装配是否能完成抵达细胞膜发挥作用的任务等都是摆在课题组面前的“拦路虎”。

抵达膜上仅仅是第一步。“要想GPCR接受信号分子多巴胺后产生的扭转牵动荧光蛋白扭转后发光，两个蛋白的连接方式起决定作用。”井淼解释，“有的情况下，受体的构象改变可能无法有效传递给荧光蛋白以产生荧光变化。”

知己知彼，百战百胜。由于对GRCR蛋白三维构象、核心基团、结构作用力等的精准了解，李毓龙团队对其基因水平上的改造和雕琢，能够做到恰到好处。实验证明，长时间表达该探针对模式生物的生长状态无明显影响。利用该探针，他们检测到了电刺激小鼠脑片引发的多巴胺释放，并在活体果蝇、斑马鱼和小鼠的大脑中检测到了与嗅觉刺激、视觉刺激、学习记忆、交配行为相关的多巴胺信号变化。

精益求精，探针灵敏度不断“进化”

“人们可能从来不知道这里有神经信号释放，但是如果有一个非常灵敏的探针，就可能会看到。”井淼说，文章接收后，团队始终在进行探针的优化工作，如今的探针比论文中的更加灵敏。

如果将人脑比喻成一张联络图，科学家想要做的是按图索骥，寻找例如记忆、情感等对应的神经活动的详细内容。而未来这张图的清晰度如何，是雪花、省流、标清、高清还是1080P，则完全取决于探针的灵敏度。

在突破了第一个阻碍之后，探针迎来了“修炼式”优化。“我们知道要把荧光蛋白的基因和特定的GPCR基因连在一起，可是怎么连才最优呢？”井淼说，靠左一点还是靠右一点，也可能需要在中间加一座连接的桥梁，桥梁又该怎么设计，这其中能排列组合出的方案数不胜数。

“我们通过找到一些对探针与多巴胺反应起到关键作用的位点，对基因进行定点突变，取得了探针优化的效果。”井淼介绍，实验中突变带来的结果可能有好有坏，突变后会测试其与多巴胺的反应，筛选出“改良版”，这些“改良版”随后还会进行组合尝试，不断筛选与优化，向着更高的灵敏度“进化”。经过500多个突变的尝试，团队最终获得了具有高、低亲和力的两种版本探针，适用于多巴胺释放量不同的脑区。

李毓龙认为，探针灵敏度在未来的持续优化和筛选中将可能不断提高，使其有能力示踪更多未知的神经通路，发现人类不曾观测到、还不知晓的神经系统秘密。

捕捉神经活动，从“闪烁”变为“多彩”

由于神经元在放电的时候会爆发出一个短暂的钙离子浓度高峰，神经元钙离子成像技术至今依然是人们观测神经活动最为直接的手段。“虽然钙离子成像能够同时反应成百上千个神经元活动，但由于许多神经递质都可以引发细胞内钙信号的变化，因此单纯通过钙成像难以知晓是何种神经递质在发挥作用。”井淼说。

有文章评价，有了钙成像技术，原本悄无声息的神经活动就变成了一幅闪烁的壮观影像。然而这种“全面开花”的成像方式难以“定点”“定性”反应精细的问题。

“神经元的兴奋性变化是否是多巴胺介导的？是某一个神经元细胞始终分泌了多巴胺，还是分阶段分泌不同浓度的多巴胺？是一整个神经元细胞的活动，还是神经元细胞中不同突触的活动？回答这些问题，才有可能弄清一些神经系统疾病的病理，从而有针对性地开发药物。”李毓龙说。

如果说，钙离子成像技术解决的是科学家终于可以“目击”神经信号在神经网络之中往来穿梭的问题，那么多巴胺荧光探针技术解决的是逐一“狙击”神经信号与现实的对应关系。

与此同时，李毓龙团队还首次成功开发了灵敏、特异、可遗传编码的乙酰胆碱荧光探针，并成功在不同生物体系中实时检测内源乙酰胆碱信号，相关论文日前已在《自然生物技术》杂志发表。可以想见，当每一种神经递质有一个不同颜色的探针对应，那神经活动将从之前的“闪烁”变为“多彩”，不同颜色代表不同的神经活动。有了趁手的工具，人们将在获得“脑图谱”的研究中迈进一大步。