确诊软下疳需进行分泌物涂片镜检、细菌培养、核酸检测、血清学检查等实验室检测，结合典型临床表现可明确诊断。
1、分泌物涂片镜检取溃疡处分泌物进行革兰染色，镜下发现短链状排列的杜克雷嗜血杆菌可辅助诊断，但阳性率较低。
2、细菌培养采用特殊培养基分离培养杜克雷嗜血杆菌，是诊断金标准，但培养条件苛刻需3-5天出结果。
3、核酸检测通过PCR技术检测细菌DNA，灵敏度超过90％，可快速鉴别杜克雷嗜血杆菌与其他病原体感染。
4、血清学检查检测梅毒螺旋体抗体和HIV抗体用于鉴别诊断，软下疳患者需排除合并其他性传播疾病可能。
出现生殖器溃疡伴疼痛、淋巴结肿大等症状时，应及时至皮肤性病科就诊，避免自行用药延误治疗。
