腰椎穿刺的解剖层次依次为皮肤、皮下组织、棘上韧带、棘间韧带、黄韧带、硬膜外腔、硬脊膜、蛛网膜，最终到达蛛网膜下腔。操作需严格遵循无菌原则，定位常选择L3-L4或L4-L5间隙，进针方向与脊柱垂直，缓慢推进至脑脊液流出。
1、皮肤与皮下组织穿刺针首先穿过皮肤及富含脂肪的皮下组织层。此层需注意消毒范围应超过穿刺点周边15厘米，避免毛囊细菌污染。肥胖患者可能因脂肪层过厚导致定位偏差，需术前触诊确认髂嵴最高点平L4棘突的体表标志。
2、棘上韧带与棘间韧带针尖依次穿透连接棘突顶端的棘上韧带和棘突间的棘间韧带。这两层韧带质地坚韧，进针时会感受到明显阻力。老年患者韧带可能钙化，需适当增加穿刺力度但避免暴力操作，防止针尖偏斜损伤神经根。
3、黄韧带突破感黄韧带是判断进入椎管的重要标志，由弹性纤维构成。当针尖穿透黄韧带时术者可感知落空感，此时针尖已到达硬膜外腔。操作时应保持针芯在位，避免硬膜外静脉丛损伤导致出血。
4、硬脊膜与蛛网膜继续推进将穿透硬脊膜和蛛网膜，两层膜常被一并穿透。此处需控制进针速度，儿童患者硬脊膜弹性较大，突破感可能不明显。穿刺成功后可见清亮脑脊液滴出，若为血性需判断是损伤性出血还是病理性出血。
5、蛛网膜下腔定位最终目标为蛛网膜下腔，内含脑脊液。成人进针深度约4-6厘米，儿童约2-3厘米。穿刺成功后应测量初压，留取脑脊液分装3管送检。操作全程需监测患者生命体征，观察是否出现头痛、下肢放射痛等异常反应。
术后患者需去枕平卧6小时预防低颅压头痛，24小时内避免剧烈活动。观察穿刺点有无渗血渗液，出现持续头痛或发热应及时就医。日常可适量补充水分促进脑脊液再生，但禁止擅自服用止痛药物掩盖症状。操作者应定期进行模拟训练维持手法熟练度，复杂病例建议在超声引导下实施穿刺。
