免疫组化技术主要通过免疫荧光法、免疫酶标法、免疫金标法、免疫电镜法和多重标记法五种方法实现组织或细胞中抗原的定位检测。
1、免疫荧光法：
利用荧光素标记抗体与靶抗原结合，在荧光显微镜下观察发光信号。该方法灵敏度高，可同时标记多种抗原，但需避光操作且荧光易淬灭。常见荧光素包括异硫氰酸荧光素、罗丹明等，适用于冰冻切片或培养细胞的快速检测。
2、免疫酶标法：
通过辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶等酶标记抗体，经底物显色反应形成可见沉淀。该方法结果稳定可长期保存，普通光学显微镜即可观察，广泛应用于石蜡切片。典型技术包括ABC法和SP法，需注意内源性过氧化物酶的灭活处理。
3、免疫金标法：
采用胶体金颗粒标记抗体，通过银增强反应放大信号，可在光镜或电镜下观察。该技术背景干扰小，特别适用于膜抗原检测，但操作流程较复杂。纳米金颗粒直径通常选择5-40纳米以适应不同分辨率需求。
4、免疫电镜法：
结合电子显微镜的超微结构观察与免疫标记技术，分为包埋前法和包埋后法。铁蛋白或纳米金标记抗体可精确定位亚细胞器抗原，需注意样本固定方式对抗原活性的影响，常用于病毒颗粒或细胞器相关研究。
5、多重标记法：
通过不同荧光素或酶系统的组合，实现单一样本中多种抗原的同时检测。需严格选择抗体种属来源避免交叉反应，搭配光谱拆分技术可完成5色以上标记，在肿瘤微环境分析中具有独特优势。
实施免疫组化前需根据检测目标优化样本处理流程，石蜡切片需进行抗原修复处理，冰冻切片应注意保持低温防止抗原降解。抗体选择应考虑克隆性、种属匹配及效价验证，设立阳性对照和阴性对照保证结果可靠性。操作中需规范洗涤步骤减少非特异性染色，显色时间控制直接影响信号强度判定。结果解读需结合组织形态学特征，强阳性信号需与内源性色素沉着鉴别。日常维护应定期校准仪器设备，规范保存抗体试剂，实验记录需详细记载抗体批号、稀释比例等关键参数。