75%酒精一般能杀死支原体，但需满足一定接触时间和条件。支原体对酒精的抵抗力较弱，但实际消毒效果可能受环境因素影响。
75%酒精通过破坏支原体的细胞膜结构使其失活，对常见的肺炎支原体、生殖支原体等均有杀灭作用。实验室条件下，酒精作用30秒至1分钟即可有效灭活大部分支原体。日常使用中，对物体表面喷洒或擦拭酒精并保持湿润状态1分钟以上，能达到较好的消毒效果。衣物、医疗器械等物品浸泡消毒时，建议延长至5分钟以上。酒精对干燥环境中的支原体杀灭效率较高，但有机物污染严重的区域需先清洁再消毒。
部分特殊支原体可能对酒精存在一定抵抗力，如某些动物源性支原体。高浓度蛋白质环境可能降低酒精的渗透效果，血液、痰液等污染物覆盖的支原体需要更长时间接触。酒精蒸汽对空气中悬浮的支原体杀灭效果有限，不能替代紫外线或过滤消毒。反复冻融的支原体标本可能因细胞膜结构改变而影响酒精敏感性。
使用酒精消毒时需确保有效浓度，存放过久或挥发后的酒精可能降低杀菌效果。对医疗器械消毒应参照规范操作流程，皮肤消毒需按照七步洗手法确保全面覆盖。支原体肺炎患者接触过的物品应重点消毒，但治疗仍需配合阿奇霉素片、盐酸多西环素片等抗生素。日常预防应注意通风换气，酒精消毒可作为辅助手段。