从血液中分离血清可通过离心法、自然凝固法或促凝剂辅助法实现。
离心法是最常用的血清分离方法，需将采集的血液样本静置30-60分钟待其自然凝固后，放入离心机以1000-2000倍重力加速度离心5-10分钟，此时血液会分层形成上清液血清层、中间纤维蛋白层及下层血细胞层，用移液管吸取上层透明液体即为血清。自然凝固法则将血液置于37摄氏度环境中静置2-4小时，待血块完全收缩后直接吸取析出的血清，但效率较低且易溶血。使用促凝剂如硅化管或凝血酶可加速纤维蛋白形成，缩短分离时间至15-30分钟，但可能影响部分生化检测结果。
分离过程需使用无菌器材避免污染，操作时避免剧烈震荡导致溶血，分离后的血清应及时检测或冷冻保存。
